Efter 25 dages statisk inkubation ved 28°C viste laccase fra *Pleurotus ostreatus* NRC620 den højeste aktivitet i svampekulturmediet. De optimale pH- og temperaturværdier for dette enzym var henholdsvis 3,0 og 70°C. Efter 2 timers inkubation ved 40°C og 50°C bevarede enzymaktiviteten henholdsvis 68,33% og 59,61%. Efter 2 timers inkubation i citrat-fosfatbuffer (pH 7,0) forblev enzymaktiviteten på 100%. Tilsætning af 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ øgede enzymaktiviteten med henholdsvis ca. 21% og 35%, mens NaCl, MnCl₂, KCl og CaCl₂ hæmmede enzymaktiviteten. Ved brug af ABTS som substrat var de kinetiske parametre (Km og Vmax) for *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase henholdsvis 1,99 mM og 16.217 μmol min−1 L−1. Enzymatisk behandling af æblejuiceprøver reducerede både pH og viskositet signifikant, og denne reduktion korrelerede med en øget opbevaringstid. Laccasebehandling resulterede i et lille fald i det samlede fenolindhold i æblejuice, men der blev ikke observeret nogen reduktion i antioxidantaktivitet.
I de senere år har forskere fokuseret på anvendelsen af grøn bioteknologi i fødevareindustrien. Laccase er et af de mest nyttige enzymer i fødevareindustrien og finder anvendelse inden for områder som juiceforarbejdning, bagning, vinstabilisering og forbedring af fødevarers organoleptiske egenskaber.1Mange højere planter og mikroorganismer udskiller laccase,2og svampe som deuteromyceter, ascomyceter og basidiomyceter kan også producere laccase.3Laccase (EC 1.10.3.2) er en blå oxidase, der reducerer molekylært ilt til vand ved hjælp af et system bestående af tre forskellige kobberatomer, hvorved forskellige phenolforbindelser og aromatiske aminer oxideres. Under produktionen af frugt- og grøntsagsjuicer er enzymatisk og ikke-enzymatisk bruning kritiske problemer.4Da disse stoffer påvirker saftens farve, smag og aroma negativt, skal de fjernes.5
Af alle frugter er æbler den mest konsumerede på verdensplan og i EU. I 2019 var æbleproduktionen den tredjestørste på verdensplan med over 87 millioner tons.6Æbler indeholder adskillige phenolforbindelser, herunder flavonoider og phenolsyrer såsom kaffesyre og klorogensyre.7Fordi æblejuice typisk indtages i sin klare form, går cirka 50% til 90% af de fenoliske komponenter tabt under filtreringsprocessen.8I dag har forbrugerne en tendens til at vælge minimalt forarbejdede produkter, såsom uklar æblejuice med et højt polyfenolindhold. På grund af det høje fenolindhold er denne type æblejuice dog særligt modtagelig for misfarvning og mørkning.9Forskellige teknologier, herunder varmebehandlingsmetoder såsom pasteurisering ved 60-90 °C, bruges til at reducere eller forhindre mørkfarvning af æblejuice.10Dog ifølge forskning fra Sauceda-Gálvez11, termisk forarbejdning kan ødelægge flygtige kemikalier og påvirke æblejuicens organoleptiske egenskaber. Alternativer til termiske forarbejdningsmetoder omfatter superkritisk kuldioxid, ultraviolet stråling, ultralyd, højt hydrostatisk tryk eller højtrykshomogenisering.12Effektiviteten af disse teknologier og udbyttet af egnede frugtsafter afhænger af de anvendte parametre og produktets egenskaber. Deres udbredte anvendelse er begrænset af høje omkostninger, negative virkninger på kvaliteten af visse fødevarer eller utilstrækkelig enzyminaktivering.13,14
Laccase kan bruges til at stabilisere og klargøre frugtsaft.15Gökmen m.fl.16anbefaler brugen af laccase til klaring af frugtjuice, fordi det effektivt fjerner phenolforbindelser ved at omdanne dem til polymerer eller oligomerer, der let fjernes af enhver ultrafiltreringsmembran, hvilket gør det muligt for æblejuice at opretholde en stabil farve og klarhed i op til seks uger ved 50°C. Renset *Trichoderma*-laccase blev immobiliseret på aluminiumoxidkugler og brugt til selektivt at fjerne bismagsstoffer forårsaget af mikrobiel kontaminering af æblejuice.17
Cirka 80-90% af de flygtige komponenter i æblejuice er estere og aldehyder, som giver juicen en unik aroma.18Laccase fra *Trametes versicolor* blev immobiliseret på et billigt underlag lavet af naturlige fibre fra unge kokosnøddeskaller til klaring af æblejuice.19Tidligere studier har undersøgt stabiliseringen af æblejuice (farve og turbiditet) ved hjælp af enzymfri eller immobiliseringsmetoder eller i kombination med ultrafiltrering.5,19Effekten af svampelakkaser på æblejuices fysisk-kemiske egenskaber under opbevaring er dog fortsat uklar. Formålet med denne undersøgelse var derfor eksperimentelt at undersøge ændringerne i æblejuices fysisk-kemiske egenskaber, indholdet af fenolforbindelser og antioxidantaktiviteten efter behandling med svampelakkaser og to ugers opbevaring i køleskab. Laccaser har evnen til at oxidere fenolforbindelser, hvilket gør dem lovende til brug i forskellige industrielle processer, herunder juiceklaring. Denne undersøgelse undersøgte laccaser fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620 med fokus på de ideelle betingelser for deres aktivitet og effektivitet i juiceklaring. Mens forskning i østershatte (P. ostreatus NRC 620) stadig er begrænset, har tidligere undersøgelser undersøgt enzymer fra forskellige svampekilder, såsom Trametes versicolor og Ganoderma lucidum. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere den potentielle anvendelse af dette enzym i fødevareindustrien og fremhæve dets unikke egenskaber, især dets ideelle pH og temperatur.
2,2'-Azooxybis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) blev købt fra Sigma-Aldrich (Canada). Alle andre reagenser var af analytisk kvalitet.
National Research Centers Microbial Culture Collection Center indhentede den kendte østershattestamme NRC620. Efter subkultur blev denne stamme opbevaret på kartoffeldextroseagarplader ved 4°C. Inokulumforberedelsesmetoden var som følger: 10 dage gammelt, fuldt udviklet mycelium blev inokuleret på kartoffeldextroseagarplader og inkuberet ved 28°C. Efter 10 dage blev tre mycelieblokke med en diameter på 12 mm fjernet fra agarmediet ved hjælp af en steril metalstempel og placeret i 250 ml Erlenmeyer-kolber med bomuldspropper indeholdende 50 ml steriliseret kulturmedium (pH 5,0, som tidligere beskrevet af Othman et al.20Kulturerne blev inkuberet ved 28 °C i 18 dage. Kulturerne blev derefter filtreret gennem Whatman nr. 1 filterpapir, og den resulterende supernatant fungerede som enzymkilde.
Laccaseaktivitet blev bestemt ved brug af ABTS som substrat. Reaktionsblandingen (2 ml) indeholdt 500 μL 0,3 mM ABTS (opløst i 0,1 M natriumcitratbuffer, pH 4,5) og den nødvendige mængde enzymprøve fortyndet med destilleret vand.21,22I betragtning af at laccase kan oxidere ABTS ved stuetemperatur (28 °C ± 2), blev ABTS-oxidation bestemt ved at måle stigningen i absorbans ved 420 nm (ε420= 36.000 cm²-1 M -1) ved hjælp af et Agilent Carry-100 UV-spektrofotometer. Én enhed laccaseaktivitet var nødvendig for at oxidere 1 μmol ABTS pr. minut. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden med bovint serumalbumin som intern kontrol.23,24
Efter at enzymet var udvundet fra østershattestammen NRC 620, blev dets aktivitet målt ved forskellige dyrkningsintervaller i 25 dage under statiske forhold ved 28 °C.
For at undersøge temperaturens effekt på laccaseaktivitet blev der udført forsøg i temperaturområdet fra 20 til 90 °C. Før enzymet blev tilsat og reaktionen blev startet, blev bufferen (0,1 M natriumcitrat, pH 4,5) og substratet (ABTS) blandet og inkuberet i 5 minutter ved forskellige temperaturer. Enzymets termiske stabilitet blev vurderet ved inkubation i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) ved henholdsvis 40, 50, 60 og 70 °C i 2 timer. Resterende aktivitet blev derefter vurderet ved hjælp af ABTS-substratet.
Effekten af pH på laccaseaktivitet blev vurderet ved brug af ABTS som substrat i 0,1 M citrat-fosfatbuffere med et pH-område på 2,5 til 7,0. Enzymopløsningen blev inkuberet ved 40 °C i to timer i 0,1 M citrat- og Tris-buffere (pH 3, 4, 6 og 7) for at vurdere pH-stabilitet. Restaktivitet med ABTS som substrat blev beregnet efter inkubation.
Laccasen blev inkuberet i 10 minutter i natriumfosfatbuffer (0,05 M, pH 7,0) indeholdende forskellige metalioner (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ og Mn2+) i koncentrationer på henholdsvis 2,5 mM og 10 mM. Substratet (ABTS) blev derefter tilsat for at starte reaktionen, og den relative aktivitet blev vurderet.
ABTS-oxidation med laccase ved forskellige koncentrationer (0,025-3 mM) blev målt ved pH 4,5 for at bestemme de kinetiske parametre (Vmax og Km). Den kinetiskekonstanteraf Michaelis-Menten-ligningen blev beregnet ved hjælp af et Lineweaver-Burk-plot, som afbilder den reciprokke værdi af reaktionshastigheden som funktion af substratkoncentrationen. De kinetiske konstanter blev beregnet ud fra Lineweaver-Burk-plottet ved hjælp af GraphPad Prism version 6.01-software.
Efter grundig vask af æblerne med vand fra hanen blev de skåret i halve og presset ud med en fuldautomatisk Braun MP80 æblejuicer (fremstillet i Tyskland). Saften blev filtreret gennem fire lag ostelærred. Der blev ikke tilsat enzymer til kontrolgruppen, mens 2,0% laccase (den mest effektive koncentration, der blev testet) blev tilsat til frisktilberedt æblejuice, som derefter blev opbevaret ved 4°C i to uger.
Titrerbar surhedsgrad (TA) og pH blev bestemt i henhold til metoden fra Boulton et.al.27PH-værdien for hver prøve blev målt ved hjælp af et digitalt pH-meter (JENWAY 3510 pH-meter). Titrerbar surhedsgrad (TA) blev beregnet baseret på æblesyre ved hjælp af følgende formel.
Hvor V og C er henholdsvis volumen (ml) og koncentrationen (0,1 mol/l) af den natriumhydroxidopløsning, der anvendes i titreringen. K er æblesyreomdannelseskoefficienten, lig med 0,067, og W er massen (g) af æblejuice.
De samlede opløselige faste stoffer (TDS)-indholdet i alle juiceprøver blev bestemt ved hjælp af et PAL-1 lommerefraktometer (ATAGO, Tokyo, Japan). Efter hver måling blev den optiske linse skyllet med deioniseret vand, og hver æblejuiceprøve blev testet tre gange. Værdien for hver prøve blev beregnet ved at gennemsnittet af de tre målinger. Middelværdien ± standardafvigelsen for hver æblejuiceprøve blev også beregnet ved at gennemsnittet af disse resultater.
Viskoelasticiteten af æblejuiceprøverne blev vurderet ved hjælp af et rotationsviskosimeter (RV, Rheotest 2, Tyskland). Prøven blev placeret inde i viskosimeterets "S2"-cylinder. Den tilsyneladende viskositet blev repræsenteret ved hældningen af forskydningsspændings- versus forskydningshastighedskurven, som blev beregnet ud fra forskydningsspændingen og de tilsvarende kurver ved forskellige forskydningshastigheder (fra 1,00 til 437,4 s⁻¹). Formlen til beregning af den tilsyneladende viskositet er som følger:
Hvor η er den tilsyneladende viskositet (cP), τ er forskydningsspændingen (dyn/cm²), γ er forskydningshastigheden (sec⁻¹), og (τ) beregnes ved hjælp af moment- (α) og cylinder- (Z) værdierne ved hjælp af følgende formel: τ = Z . α.
Bruningsindekset blev bestemt i henhold til Meidavs metode et al.al.29En 10 ml juiceprøve blev centrifugeret ved 2750 xg i 10 minutter. 5 ml af juicesupernatanten blev blandet med 5 ml 95% ethanol. Blandingens absorbans blev målt ved 420 nm ved hjælp af et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC).
Det samlede fenolindhold (TPC) blev bestemt kolorimetrisk ved hjælp af Folin-Ciocalteu-reagenset som beskrevet af Boulton et al.[27]En standardkurve for gallussyre blev konstrueret for koncentrationer fra 0 til 500 mg/L (r²= 0,997). Resultaterne er udtrykt som gallussyreækvivalenter (mg GAE/ml).
Tilsæt 125 μL destilleret vand og 2850 μL FRAP-opløsning til 25 μL æblejuice, og lad blandingen stå i mørke i30min. Mål derefter absorbansen ved 593 nm ved hjælp af et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). FRAP-reagenset blev fremstillet ved at blande 300 mM acetatbuffer (pH 3,6), 20 mM jern(III)chlorid og 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazin (TPTZ) (opløst i 40 mM HCl) i et forhold på 10:1:1. En standardkurve blev genereret ved hjælp af Trolox som standard (R²= 0,999), og resultaterne udtrykkes som μM Trolox/ml.
Antioxidantaktiviteten af de behandlede og ubehandlede juicer blev bestemt ved hjælp af DPPH-metoden for at evaluere deres evne til at opfange DPPH-frie radikaler.31Ti mikroliter juice blev blandet med 1 ml af en DPPH-opløsning (100 μM) i methanol. Efter reaktion i mørke i 30 minutter blev blandingens absorbans målt ved 517 nm ved hjælp af et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). Resultaterne blev udtrykt som troloxækvivalenter (μM trolox/ml) baseret på en kalibreringskurve (R2= 0,990).
De opnåede data viste, at maksimal laccaseproduktion blev observeret i NRC 620 østershatte ved udgangen af den 18. fermenteringsdag, hvor aktiviteten nåede 1302 U/L. Dette tjente som grundlag for at bestemme den optimale dyrkningstid for laccaseproduktion (Figur 1). Selvom enzymproduktionen steg med stigende dyrkningstid, var stigningshastigheden ikke direkte proportional med dyrkningstiden; efter 21 dage var enzymaktiviteten kun steget med 90 U/L (til 1390 U/L). Derfor blev 18 dage i sidste ende valgt som den optimale dyrkningstid for at afbalancere produktudbyttet med de økonomiske fordele ved øget dyrkningstid.
Effekt af dyrkningstid på laccaseudbytte i Pleurotus ostreatus NRC 620. Tre (12 mm) svampemycelieblokke blev inokuleret i 50 ml sterilt medium og derefter dyrket ved 28 °C i forskellige tidsrum.
I overensstemmelse med andre undersøgelser indikerer vores resultater, at den ideelle dyrkningsperiode for at opnå maksimal laccasesekretion af svampe sandsynligvis er mellem 7 og 36 dage.32Ifølge Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 producerede den højeste mængde laccase ved udgangen af den niende fermenteringsdag med en specifik aktivitet på 1637 U/mg protein. Desuden har Othman et al.34fandt, at *Trichoderma harzianum* S7113 udskilte en stor mængde laccase på dyrkningens femte dag. Laccaseproduktionen nåede et højdepunkt på den fjortende dag og faldt derefter gradvist.34Selvom enzymsekretion også kan forekomme i den primære vækstfase, topper den normalt i den mellemliggende fase og udløses af forbruget af en kulstof- eller nitrogenkilde.34,35
Selvom laccase fra Pleurotus ostreatus NRC 620 udviste høj aktivitet over et bredt temperaturområde fra 50 °C til 80 °C, nær maksimal aktivitet (69-98%), blev dens maksimale aktivitet observeret ved 70 °C (fig. 2a). Uden for dette temperaturområde faldt enzymaktiviteten ved cirka 70 °C. Disse resultater tyder på, at enzymet er aktivt ved høje temperaturer, sandsynligvis fordi høj temperatur øger reaktionens kinetiske energi.
Effekt af reaktionstemperatur (a) og pH (b) på laccaseaktivitet i *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturer i området fra 20 til 90 °C blev opnået ved at præinkubere blandingen ved forskellige temperaturer i 5 minutter, før enzymet blev tilsat og reaktionen blev startet. Effekten af pH på laccaseaktivitet blev vurderet ved hjælp af ABTS som substrat i opløsninger indeholdende 0,1 M citrat-fosfatbuffer over et pH-område på 2,5 til 7,0.
Ifølge Ezike et al.al.33, den optimale temperatur for *Trametes polyzona* WRF03 laccase er 55 °C, hvilket er den samme som for *Ganoderma lucidum*laccase36og svarer til den optimale temperatur (50 °C) for *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38bemærker, at ligesom for andre lignin-nedbrydende enzymsystemer er det ideelle temperaturområde for laccase mellem 50 og 70 °C.
Resultaterne viste, at enzymet udviste den højeste aktivitet ved pH 3,0 og nåede 94 % aktivitet ved pH 3,5. Det forblev dog aktivt over et bredt pH-område fra 2,5 til 7,0 (figur 2b). Desuden udviste det højere aktivitet under sure forhold sammenlignet med neutrale eller alkaliske forhold. Dets aktivitet forblev mindst 77 % over pH-området fra 2,5 til 4,5, men nåede kun cirka 38 % ved pH 7,0. Den optimale pH for laccase fra *Trametes polyzona* WRF03 var 4,533, hvilket er den samme som pH for laccaser fra *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 og *Trametes hirsuta* 41. Ifølge undersøgelsen foretaget af Chairin et al.42, den optimale pH for laccase fra *Polymorpha f. sp.* WR710-1 er 2,2, mens den optimale pH for laccase fra *Polymorpha f. sp.* IBL-04 er 5,043. Bindingen af hydroxidanioner (laccasehæmmer) til kobberatomerne i T2/T3-laccase kan være årsagen til den nedsatte laccaseaktivitet under neutrale eller alkaliske pH-forhold. Dette kan forstyrre den interne elektronoverførsel fra T1-centret til T2/T3-centret, hvorvedbegrænsendeenzymaktiviteten23,44
Ved at inkubere enzymet ved forskellige temperaturer blev det konstateret, at både inkubationstid og temperatur påvirkede enzymets stabilitet. Det er værd at bemærke, at laccase fra *Trametes polyzona* NRC 620 udviste højere stabilitet ved 40℃ og 50℃ og bevarede henholdsvis 68,33% og 59,61% af sin oprindelige aktivitet efter 120 minutter (figur 3a). I modsætning hertil bevarede laccase fra *Trametes polyzona* WRF03 under de samme betingelser (40℃ og 50℃, 120 minutter) henholdsvis 64,38% og 42,92% af sin aktivitet.33Tværtimod mindskede øget inkubationstid og temperatur stabiliteten af *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; efter inkubation ved 60 ℃ og 70 ℃ i 60 minutter faldt dens aktivitet til henholdsvis 39,24% og 1,72% (figur 3a). I overensstemmelse med de eksperimentelle resultater viste laccase fra *Trametes polyzona* WRF03 højere stabilitet ved 40 og 50 ℃ gennem hele den termiske behandlingsprocessen.33Tilsvarende Lueangjaroenkit et al.al.37og Chairin etal.42rapporterede stabiliteten af laccaser fra henholdsvis Trametes polyzona KURNW027 og Trametes polyzona WR710-1 ved 50 °C i 1 time. Som en nyttig biokatalysator, der kan anvendes inden for forskellige bioteknologiske områder, bør laccase have god stabilitet og ydeevne over et bredt temperaturområde.
Termostatisk stabilitet (a) og pH-stabilitet (b) af laccase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatisk stabilitet blev vurderet ved at inkubere enzymopløsningen i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) ved henholdsvis 40, 50, 60 og 70 °C i 2 timer. pH-stabilitet blev vurderet ved at inkubere enzymopløsningen i 0,1 M citratbuffer og Tris-buffer (pH 3, 4, 6 og 7) ved 40 °C i 2 timer. Restaktivitet blev beregnet ved hjælp af ABTS som substrat efter inkubation.
For at bestemme de optimale betingelser for enzymbrug og -opbevaring undersøgte vi effekten af pH på laccases stabilitet. Eksponering for forskellige pH-værdier påvirkede proteinstrukturens stabilitet signifikant og påvirkede dermed enzymmolekylets stabilitet og aktivitet. Resultaterne viste, at enzymet var mindre stabilt under sure forhold, mens det udviste bedre stabilitet ved højere pH-værdier (neutrale og alkaliske områder). Ved pH-værdier på 7,0, 6,0, 4,0 og 3,0 var enzymretentionsraterne efter 120 minutter henholdsvis ca. 100 %, 62,54 %, 52,39 % og 11,14 % (fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03 laccase viste højere stabilitet ved neutrale pH-værdier (5,5-6,5) og lavere stabilitet ved sure pH-værdier (under 4,0). Efter 120 minutter ved pH-værdier på 5,5, 6,0 og 6,5 var enzymretentionsraterne henholdsvis cirka 82 %, 100 % og 93 %.33Khairin m.fl.42bemærkede, at laccase fra Trametes polyzona WR710-1 var stabil i pH-området 6,0 til 7,0, mens Sayed et al.45viste, at laccase var mere stabil under neutrale pH-forhold. Laccase fra Cerrena unicolor udviste dog også stabilitet under alkaliske forhold (pH 9,0).46De undersøgte laccaser udviste høj stabilitet over et bredt pH-område. Dette kan være en vigtig egenskab til industrielle anvendelser.
Da nogle metalioner har både stimulerende og hæmmende virkninger på enzymaktivitet, skal deres virkninger på enzymaktivitet tages i betragtning i industrielle anvendelser. Dette er afgørende, fordi metalioner er almindelige miljøforurenende stoffer, der kan påvirke stabiliteten og syntesen af ekstracellulære enzymer.47For at undersøge virkningerne af flere metalioner på laccase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620, udførte vi tilsvarende eksperimenter. Som vist i figur 4, påvirkede en forøgelse af metalionkoncentrationen fra 2,5 mM til 10 mM enzymfunktionen negativt, afhængigt af den anvendte metaltype. For eksempel,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, ogCu²⁺kunne stimulere og aktivere enzymaktiviteten, mensNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, ogK⁺kunne hæmme enzymaktiviteten. Ved en koncentration på 10 mM var Cu²⁺- og Mg²⁺-ioner de mest potente aktivatorer af laccaseaktivitet fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620, hvilket gav en aktiveringsgrad på henholdsvis ca. 34% og 20%. Ved en koncentration på 10 mM var Ca²⁺-ioner imidlertid den mest potente hæmmer af laccase og reducerede enzymaktiviteten med ca. 60%.
Effekten af metalioner på aktiviteten af Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. Laccasen blev inkuberet i 10 minutter i natriumfosfatbuffer (0,05 M, pH 7,0) indeholdende forskellige metalioner i koncentrationer på 2,5 mM og 10 mM. Reaktionen blev derefter initieret ved tilsætning af substratet (ABTS), hvorefter den relative aktivitet blev målt.
Vores resultater stemmer overens med andre forfatteres resultater, der fandt, at Mg²⁺ og Cu²⁺ forstærker aktiviteten af *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ fandt, at laccase fra *Xylaria* sp. i et vist omfang stimuleres af kobberioner (Cu²⁺). Desuden udførte Foroutanfar et al.⁴⁹ og Si et al.⁵⁰ lignende undersøgelser af laccaser fra henholdsvis *Paraconiothyrium variabile* og *Trametes pubescens*. Type II-kobberbindingsstedet (T2) for dette enzym kan mættes med Cu²⁺ ved en given koncentration, hvilket kan forklare stimuleringen af laccaseaktivitet ved højere Cu²⁺³⁹-koncentrationer. Da hvidrådsvampe-laccaser er oxidaser, der indeholder flere kobberatomer, er virkningerne af kobberioner på laccaseaktiviteten forskellige og spænder fra stimulerende og hæmmende til neutral.⁵¹ I modsætning hertil har Zhou et al.[52]rapporterede, atCu²⁺hæmmede laccaseaktiviteten hos taiwanesiske underjordiske termitter (Odontotermes formosanus). Imidlertid viste laccaser hos Cerena sp. HYB07[53]og Clitocybe maxima[54]blev ikke påvirket af kobberioner.
Substratspecificiteten blev repræsenteret ved dens kinetiske parametre (Km og Vmax); jo stærkere substratets bindingsevne til enzymet er, desto lavere er Km-værdien og desto højere er substratspecificiteten.3,21,55De kinetiske parametre (Km og Vmax) for laccase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620 blev bestemt ved hjælp af GraphPad Prism 6.0-softwaren ved at plotte Lineweaver-Burk-plottet (Figur 5). Ved brug af ABTS som substrat var resultaterne 1,99 mM og 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,henholdsvis Elsayed et al.21rapporterede, at Km-værdierne for ABTS-oxidation var henholdsvis 0,1 mM og 0,064 mM, hvilket indikerer en høj affinitet af Lac A- og Lac B-isoenzymer for ABTS. Desuden var Vmax-værdierne 0,182 μmol.min⁻¹og 0,603 μmolmin⁻¹Den opnåede Km-værdi var lavere end den for Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); desuden var deres Vmax-værdi (1429 mmol min⁻¹) ogsåsænkenår ABTS anvendes som substrat.33 Tilsvarende var Km-værdierne for Lentinus squarrosulus MR13 og Trametes sp. AH28-2 laccasekoncentrationerne henholdsvis 0,0714 mM og 0,025 mM, og Vmax-værdierne var 0,0091 mM min−1 og 0,67 mM min−1 mg−1 (i forhold til ABTS)henholdsvis 56,57
Effekten af ABTS-koncentration på aktiviteten af laccase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620 blev undersøgt, og et Lineweaver-Burk-plot af den reciprokke værdi af den indledende reaktionshastighed versus ABTS-koncentration blev plottet. Oxidationsreaktionen af ABTS med forskellige koncentrationer (0,025-3,0 mM) af laccase blev målt ved pH 4,5 for at bestemme de kinetiske parametre (Vmax og Km). Michaelis-Mentens kinetiske konstanter blev beregnet ved hjælp af Lineweaver-Burk-plottet af den reciprokke værdi af reaktionshastigheden versus substratkoncentrationen. De kinetiske konstanter blev beregnet ud fra Lineweaver-Burk-plottet ved hjælp af GraphPad Prism 6.01-softwaren.
Traditionelle klaringsenzymer, såsom pektinaser, hydrolyserer pektinstoffer, hvilket reducerer viskositet og turbiditet. De nedbryder effektivt strukturelle polysaccharider og bruges ofte i kombination med andre enzymer, såsom cellulaser og hemicellulaser, for at forbedre udbytte og klarhed. Pektinaser er dog ikke specifikt rettet mod phenolforbindelser, som er de primære bidragydere til turbiditet og oxidativ bruning, især i juicer som æble- og druesaft.58I modsætning hertil katalyserer laccaser oxidationen af phenolforbindelser ved at polymerisere dem til større, uopløselige molekyler, der kan fjernes ved sedimentation eller filtrering. Denne mekanisme forbedrer ikke kun klarheden, men forlænger også juicens holdbarhed ved at reducere sandsynligheden for oxidativ brunfarvning forårsaget af phenolforbindelser. Desuden kan laccasebaserede klaringprocesser udføres under milde forarbejdningsbetingelser (pH 3,5-5,5, temperatur 25-40 °C), hvilket gør dem velegnede til delikate juicer uden at gå på kompromis med deres ernæringsmæssige eller organoleptiske egenskaber.59Studier har vist, at pektinasebehandling kan klare juice på 1-2 timer, mens laccasebehandling typisk kræver en længere reaktionstid (3-6 timer) for fuldstændigt at reducere phenolforbindelser. Denne proces kan dog optimeres ved at immobilisere enzymet eller ved at kombinere laccase med mekaniske klarningsmetoder.60I denne undersøgelse afslørede enzymprofilering af det rå ekstrakt signifikant laccase- og α-amylase-aktivitet, mens pektinase- og xylanase-aktivitet var ekstremt lav, og cellulase-aktivitet ikke blev detekteret. Derfor skyldtes reduktionen i turbiditet og phenolindhold primært laccases virkning, mens ændringen i viskositet delvist kunne skyldes amylases virkning.
Tabel 1 viser de fysisk-kemiske parametre for friskpresset æblejuice og laccasebehandlede prøver. Resultaterne viste, at udbyttet af friskpresset æblejuice (71,59%) var lavere end udbyttet af laccasebehandlede prøver (87,34%). Disse resultater er i overensstemmelse med Pilnik og Oranges resultater.61, som angav, at brugen af enzymer i frugtforarbejdning kan øge juiceudbyttet, forbedre filtreringen og opnå klar juice af høj kvalitet til koncentration. Stigningen i juiceudbytte skyldes primært stigningen i indholdet af opløselige sukkerarter i juicen. Under enzymatisk hydrolyse af frugter ødelægges mesoglea og pektin i produktets cellevægge og omdannes til opløselige stoffer såsom neutrale sukkerarter og syrer.62.pH-værdien af den enzymbehandlede æblejuice var signifikant lavere end kontrolgruppens (P < 0,05), og pH-værdien for begge grupper steg signifikant under opbevaring (Tabel 1). Disse resultater er i overensstemmelse med resultaterne fra Mark et al.63, som bemærkede, at pH-værdien i cashewnødjuice faldt efter opbevaring efter varmebehandling. Pektin-nedbrydning og dannelse af galacturonsyre efter enzymbehandling kan være ansvarlig for stigningen i pH under opbevaring. pH-værdien i enzymbehandlede prøver forblev mellem 4,05 og 4,31 under hele opbevaringen, mens pH-værdien i ubehandlet æblejuice lå mellem 4,12 og 4,33.
Den samlede surhedsgrad (TA) for både ubehandlede og laccasebehandlede prøver viste en faldende tendens med stigende opbevaringstid (Tabel 1). Faldet i surhedsgrad blev tilskrevet omdannelsen af organiske syrer til kulhydrater eller enzymatiske reaktioner, samt oxidation under opbevaring af juice.64Den samlede surhedsgrad i kontrolprøverne af æblejuice og enzymbehandlede prøver var lavere end i andre juicer (jordbærjuice 0,9%, blommejuice 2,2%, kumquatjuice 1,0%, abrikosjuice 2,4%, appelsinjuice 0,8%), men svarede til andre juicer (f.eks. pærejuice 0,3%).62Disse forskelle i ubehandlet friskpresset æblejuice kan skyldes forskellige faktorer såsom vækstbetingelser, genetiske faktorer, modningsniveau og forarbejdningsmetoder.65Faldet i den totale surhedsgrad i kontrol- og laccasebehandlet æblejuice er i overensstemmelse med resultaterne præsenteret af Singh et al.66vedrørende faldet i den samlede surhedsgrad i Jin Nuo æblejuice efter 74 dages opbevaring. På den anden side, Oshmiansky og Wojdylo67fandt ingen signifikante ændringer i æblejuices surhedsgrad, når man undersøgte effekten af traditionelle klaringsmetoder.
Resultaterne vist i tabel 1 viser, at den samlede værdi af opløselige tørstoffer (TSS) i den laccasebehandlede æblejuice var højere end i den ubehandlede prøve. Disse resultater er i overensstemmelse med de publicerede undersøgelser.. 68Desuden viser tabel 1, at TSS-værdien for kontrolgruppen med æblejuice var 9,58 på det indledende tidspunkt og nåede 11,05 ved udgangen af opbevaringsperioden. Disse værdier er lavere end TSS-værdierne for frisk æblejuice rapporteret af Hamid et al.. 69(henholdsvis 11,2 og 11,80). TSS-værdien for de laccasebehandlede æblejuiceprøver steg signifikant, startende fra 11,23 og nåede 12,93 efter to ugers opbevaring ved 4°C (Tabel 1). En lignende stigning i TSS under opbevaring blev også observeret i citrusfrugter, citroner og søde appelsiner. Stigningen i det samlede opløselige tørstof (TSS) under opbevaring kan skyldes hydrolysen af polysaccharider (stivelse) til monosaccharider (sukkerarter), stigningen i koncentrationen på grund af juicedehydrering og nedbrydningen af pektin i juicen til opløselige tørstoffer. Stigningen i det samlede opløselige tørstof (TSS) skyldes sandsynligvis stigningen i opløselige sukkerarter, som kan dannes ved omdannelse af pektin eller cellulose til opløselige sukkerarter af henholdsvis pektin eller cellulase, eller ved hydrolyse af stivelse til sukkerarter, som rapporteret af Hamed et al.69.Effekten af laccase på æblejuicens egenskaber kan observeres visuelt, da laccasebehandlet æblejuice udviser bedre flydeevne og lavere viskositet end ubehandlet juice. Denne observation er vist i tabel 1; Viskositeten af den enzymbehandlede prøve var 1,87 cP, mens viskositeten af kontrolprøven var 2,95 cP. Dette signifikante fald i viskositet skyldes sandsynligvis den højere vandholdende kapacitet af pektinlignende stoffer og dannelsen af en sammenhængende netværksstruktur.
I denne undersøgelse blev effekten af laccase på bruningsindekset (BI) for æblejuice undersøgt ved at måle absorbansen ved 420 nm ved hjælp af et spektrofotometer. Resultaterne er vist i tabel 1. Under opbevaring viste BI af æblejuiceprøver i både den behandlede og den ubehandlede gruppe en gradvis stigende tendens. BI afspejler graden af bruning og kan tjene somen vigtigindikator for enzymatiske og ikke-enzymatiske bruningsreaktioner. Absorbansen steg signifikant under opbevaring (P < 0,05). Ved afslutningen af opbevaringen varA420Værdien af æblejuiceprøver i kontrol- og enzymbehandlede grupper steg med henholdsvis ca. 217 % og 121 % (Tabel 1). Resultaterne indikerer, at enzymbehandling effektivt kan reducere bruningsgraden med ca. 56 %. Resultaterne fra Bezerra et al.[19]] er i overensstemmelse med vores resultater; De brugte laccase-glutaraldehyd-kokosfibre til at klare æblejuice, hvilket reducerede dens oprindelige farve med 61 %.
Selvom polyfenoler i frugtjuice har positive ernæringsmæssige og terapeutiske virkninger på menneskekroppen, kan de også reagere med proteiner, hvilket forårsager uklarhed, sedimentation eller turbiditet i juicen, hvorved produktets smag og aroma ændres og holdbarheden reduceres.71Formålet med denne undersøgelse var at reducere indholdet af fenolforbindelser i æblejuice på en sikker måde ved hjælp af laccase fra Pleurotus ostreatus NRC 620. Resultaterne præsenteret i tabel 1 viser, at det samlede indhold af fenolforbindelser i laccasebehandlet æblejuice blev signifikant reduceret før opbevaring ved 4 °C. Desuden faldt det samlede indhold af fenolforbindelser også under opbevaring i begge undersøgte prøver (tabel 1). Forskning foretaget af Sandri et al.72viste, at enzymbehandlet æblejuice kan bevare sin antioxidantaktivitet og indhold af fenolforbindelser. Resultaterne af en undersøgelse foretaget af Lettera et al.73viser, at behandling af appelsinjuice med svampelaccase kan reducere indholdet af fenolforbindelser i den med op til 45%.
Fenolforbindelser har vist sig at have egenskaber som f.eks. opfangning af frie radikaler, reduktion og slukning af singlet-ilt, overførsel af hydrogenatomer og elektrondonation til frie radikaler, hvilket gør dem til potente antioxidanter.74Derfor blev der i dette studie anvendt DPPH- og FRAP-baserede metoder til at evaluere effekten af laccase på antioxidantaktiviteten af æblejuice opbevaret i køleskab i 14 dage (Tabel 2). Begge metoder viste en stigning i antioxidantaktivitet under opbevaring, hvilket kan skyldes stigningen i frie phenolforbindelser eller dannelsen af Maillard-reaktionsprodukter (MRP'er), hvor Maillard-reaktionsprodukter sandsynligvis er årsagen til stigningen i antioxidantaktivitet.75Ikke-enzymatiske bruningsreaktioner (herunder ascorbinsyrenedbrydning, Maillard-reaktioner og syrekatalyseret nedbrydning af sukkerarter) producerer brune pigmenter (melanoidiner). Mellemprodukter af ascorbinsyrenedbrydningsprodukter og sukkernedbrydningsprodukter (såsom carbonylforbindelser) kan reagere med aminosyrer via Maillard-reaktioner.76Selvom bruning af frugt og grøntsager under opbevaring er blevet grundigt undersøgt, er vores forståelse af disse reaktioner fortsat begrænset.77Sammenlignet med FRAP-metoden viste laccasebehandlet æblejuice signifikant lavere antioxidantaktivitet ved DPPH-metoden (Tabel 2), og antioxidantaktiviteten i alle prøver steg signifikant med stigende opbevaringstid. To forskellige metoder til bestemmelse af antioxidantaktivitet blev anvendt i denne undersøgelse, fordi deres principper er forskellige. DPPH-metoden måler evnen til at neutralisere frie radikaler, mens FRAP-metoden måler evnen til at reducere jernioner. Derfor anbefales det at anvende flere metoder til bestemmelse af antioxidantaktivitet for bedre at forstå antioxidantaktiviteten i de undersøgte prøver.78
Et af hovedresultaterne i denne undersøgelse er, at *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 udviser optimal aktivitet ved 70 °C og pH 3,0. Sammenlignet med andre svampelakkaser, der almindeligvis anvendes til klaring af juice, såsom *Trametes versicolor* og *Ganoderma lucidum* laccaser, udviser *P. ostreatus* NRC 620 højere termisk stabilitet og en mere sur pH. Laccaser fra *Trametes versicolor* og *Ganoderma lucidum* udviser typisk optimal aktivitet i området 50-60 °C og ved pH-værdier mellem 3,5 og 5,0. Denne forskel kan bidrage til forbedret klaring af juice, især for sure juicer, hvor stabilitet ved lavere pH-værdier er kritisk. Den unikke egenskab ved *P. Sammenlignet med andre undersøgte svampelakkaser udviser *Pleurotus ostreatus* NRC 620 evnen til at fungere effektivt under mere udfordrende forhold. Dens højere optimale aktivitetstemperatur antyder potentielle fordele i industrielle anvendelser, såsom hurtigere reaktionshastigheder og reduceret mikrobiel kontaminering. Dens lave pH-værdi, som er velegnet til den sure natur af mange juicer, kan være nyttig i juiceklarningsprocesser. Disse resultater berettiger yderligere undersøgelse for storskala anvendelse, hvilket gør *Pleurotus ostreatus* NRC 620 til et levedygtigt alternativ til traditionelle svampe-laccasekilder. Sammenlignet med tidligere undersøgelser fandt vi, at den optimale temperatur er 60°C, og den optimale pH-værdi er 3,0. Efter reaktion ved 60°C i 80 minutter bevarede *Ganoderma lucidum*-laccase46% af dens aktivitet.79 Ifølge Kurniawati og Nicelle80*Ganoderma lucidum*-enzymer udviser fremragende til moderat stabilitet ved 25 °C og pH-værdier fra 5,0 til 8,0, og stabilitet ved pH 6,0 og temperaturer fra 10 til 30 °C. I denne undersøgelse fandt vi, at den optimale pH og temperatur for enzymaktivitet for *Pleurotus ostreatus* var henholdsvis 3,0 og 70 °C. Efter inkubation ved 40 °C og 50 °C i to timer bevarede enzymet henholdsvis 68,33 % og 59,61 % af sin aktivitet. Desuden udviste Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase høj aktivitet over et bredt temperaturområde fra 50 °C til 80 °C og nåede næsten maksimal aktivitet (69 %–98 %), med maksimal aktivitet observeret ved 70 °C.
Afslutningsvis udviste østershattelaccase NRC620, opnået under statiske forhold, optimal aktivitet og stabilitet på tværs af en række pH- og temperaturforhold, hvilket demonstrerede overlegen stabilitet sammenlignet med andre enzymkilder. Tilsætning af 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ øgede enzymaktiviteten med henholdsvis ca. 21% og 35%. Når enzymet blev forarbejdet til æblejuice, reducerede det pH og viskositet, mens fenolindholdet kun faldt en smule under opbevaring.
Resultaterne bekræfter potentialet for laccase i fødevareindustrien, især inden for klaring af drikkevarer. Ved specifikt at nedbryde phenolforbindelser reducerer laccase ikke kun turbiditet og forbedrer klarheden, men opretholder også kvaliteten af frugtsafter under milde driftsforhold. I modsætning til traditionelle klaringmidler som gelatine, bentonit og silicagel genererer laccase ikke affald eller fjerner behagelige aromaer fra drikkevarer, hvilket gør det til en mere miljøvenlig og bæredygtig løsning. Sammenlignet med andre enzymer og filtreringsmetoder tilbyder laccase desuden en målrettet og omkostningseffektiv løsning uden at gå på kompromis med produktkvaliteten.
Kyomuhimbo, HD og Brink, HG. Anvendelser og immobiliseringsstrategier for kobberholdige laccaser; en gennemgang. Heliyon 9, e13156 (2023).
Udsendelsestidspunkt: 15. dec. 2025